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| 編輯推薦： |
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《抗体偶联药物》可供大专院校师生教学使用，也可供从事肿瘤治疗基础研究、药物研发与质量控制等领域的专业人员，以及药品监管机构从业者参考使用。
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| 內容簡介： |
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抗体偶联药物由靶向特异抗原的单克隆抗体与高效细胞毒性的小分子化学药物偶联而成。《抗体偶联药物》针对抗体偶联药物这一新型的癌症治疗手段，围绕包括其特定靶点和抗体选择、与小分子药物偶联方式等药物设计原理、工艺方法的开发和放大，以及药物质量控制技术部分进行系统总结性论述。《抗体偶联药物》首先综合叙述了抗体偶联药物的概况和研究进展，并针对抗体偶联药物研发中的关键技术环节，由在相应领域有多年经验的专家分章节予以论述。
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| 目錄：
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《新生物学丛书》丛书序
前言
第1章抗体偶联药物研发进展1
摘要1
1引言2
2抗体偶联药物的构成4
2.1抗体偶联药物的定义4
2.2抗体偶联药物识别的靶点抗原5
2.3细胞毒素药物和连接子6
2.4抗体的选择7
3目前抗体偶联药物的临床研究结果8
3.1维布妥昔单抗BrentuximabVedotinAdcetris?临床概况8
3.2曲妥珠-美坦新衍生物T-DM1临床概况9
3.3CMC-544InotuzumabOzogamicin临床概况11
3.4早期临床试验中的其他抗体偶联药物12
4挑战与前景15
致谢17
参考文献17
第2章抗体偶联药物靶标选择：关键因素25
摘要25
1引言25
2靶标选择的关键因素25
2.1特异性25
2.2表达水平26
2.3内化26
2.4靶标的异质性26
2.5可及性27
3在靶标选择中需考虑的相关因素27
3.1鉴别合适的病患群27
3.2靶抗原调节27
4实例分析：前列腺特异性膜抗原27
4.1特异性27
4.2表达水平28
4.3内化29
4.4异质性30
4.5可及性30
4.6鉴定合适的病患群31
4.7靶标的表达是否可调32
5结论33
参考文献33
第3章抗体偶联药物中抗体的选择：内化和细胞内定位36
摘要36
1引言36
2材料37
2.1流式细胞术检测内化所需试剂37
2.2细胞内定位检测所需试剂37
3方法38
3.1流式细胞术检测内化38
3.2细胞内定位检测39
4注意事项41
参考文献42
第4章抗体偶联药物的负载43
摘要43
1引言43
2美登素类化合物44
3澳瑞他汀类47
4卡奇霉素49
5毒伞肽51
参考文献53
第5章抗体偶联药物的连接子技术60
摘要60
1引言60
2化学不稳定的连接子61
2.1酸不稳定的连接子腙类61
2.2二硫化物连接子65
3酶催化裂解的连接子67
3.1肽连接子67
3.2β-葡糖苷酸连接子70
4不可裂解的连接子71
5偶联考量事项74
6结论75
参考文献76
第6章药物-接头稳定性的体内水平检测85
摘要85
1引言85
2材料87
2.1活体动物阶段87
2.2ELISA分析88
2.3TFC-MSMS分析88
3方法89
3.1PK研究89
3.2ELISA：偶联抗体和总抗体89
3.3TFC-MSMS游离药物的分析91
3.4PK分析91
4注意事项91
致谢94
参考文献95
第7章抗体偶联药物的药代动力学和ADME表征97
摘要97
1引言97
2ADC的药代动力学98
3ADCPK鉴定的分析物选择和关键参数98
3.1清除99
3.2分布容积100
4ADC优化与开发中PK的应用100
5ADCPK解释101
6ADCADME鉴定102
6.1ADC连接子在血浆中的稳定性102
6.2ADC组织分布103
6.3ADC分解代谢代谢和消除103
6.4体外DDI评估104
7结论105
致谢105
参考文献105
第8章生物制药环境下细胞毒性化合物的安全操作109
摘要109
1引言109
2ADC的工艺109
3ADC的有效负载——细胞毒性药物110
4操作人员的职业暴露风险111
5风险降低措施113
5.1暴露控制113
5.2工作环境的监控114
5.3个人的保护装备114
5.4泄露115
5.5废弃物管理115
6结论115
致谢116
参考文献116
第9章针对肿瘤靶向的细胞毒性药物与抗体铰链区巯基之间基于马来酰亚胺的
小试、中试规模偶联118
摘要118
1引言118
2材料120
2.1实验室供应和设备120
2.2试剂122
3方法122
3.1利用马来酰亚胺PEG作为替代药物的模拟偶联122
3.2小试5mg规模的ADC制备124
3.3150mg规模的ADC制备130
3.4HIC测定药物抗体偶联比DAR133
3.5聚体的SE-HPLC分析133
3.6DAR的LC-MS测定133
4注释134
参考文献137
第10章通过赖氨酸的偶联方法139
摘要139
1引言139
2材料140
3方法141
3.1一步法偶联141
3.2采用O-琥珀酰亚胺试剂的进行两步法偶联143
3.3采用亚氨基硫烷试剂进行两步法偶联148
4注释149
参考文献149
第11章基于巯基反应性连接子的位点特异性偶联：改造THIOMAB152
摘要152
1引言152
2材料153
2.1位点特异性突变153
2.2THIOMAB153
2.3偶联153
2.4疏水相互作用色谱HIC和质谱LC-MS分析154
2.5细胞表面结合154
2.6体外活性154
3方法155
3.1定点突变155
3.2在HEK293细胞中的小量THIOMAB生产155
3.3与含反应性巯基连接子的偶联156
3.4定量157
3.5改造ADC的细胞表面结合159
3.6改造ADC的体外活性160
4注意事项160
参考文献162
第12章抗体的细菌谷氨酰胺转胺酶修饰164
摘要164
1引言164
2材料166
2.1抗体和底物166
2.2去糖基化166
2.3酶偶联166
2.4抗体重链突变166
2.5质谱分析167
3方法167
3.1IgG1的去糖基化167
3.2BTGase催化偶联167
3.3定点突变以及去糖基化IgG1的制备167
3.4质谱在反应质控中的运用168
4注意事项169
致谢171
参考文献171
第13章抗体偶联药物的制剂处方研发172
摘要172
1引言172
2ADC质量属性的工艺过程考量174
3ADC制剂处方开发的考虑因素174
3.1物理稳定性175
3.2化学稳定性175
4稳定性指示方法177
4.1药物抗体偶联比率DAR的测定177
4.2反相高效液相色谱法RP-HPLC检测未偶联的小分子药物177
4.3分子排阻高效液相色谱法SE-HPLC分析分子大小异质性178
4.4非还原CE-SDS法分析分子大小异质性179
4.5活性效价180
5影响ADC制剂处方开发的生物物理因素180
6配伍研究和临床注射182
7制剂处方的决策182
参考文献182
第14章偶联工艺的开发和放大185
摘要185
1ADC工艺开发：为何、如何？185
2熟悉工艺过程186
3寻找理想的工艺参数：利用DoE作为工具187
3.1制订实验计划188
3.2使用DoE进行参数筛选的例子188
4工艺参数的验证191
5规模放大到克级水平及纯化工艺的开发191
6临床供应192
7通向商业化进程的挑战193
致谢193
参考文献194
第15章纳米载体偶联抗体的方法195
摘要195
1引言195
2材料196
2.1糖修饰组分196
2.2胺或羧酸修饰组分196
2.3巯基偶联组分196
3方法197
3.1通过高碘酸氧化的糖修饰197
3.2通过碳二亚胺的氨基或羧基修饰199
3.3通过巯基偶联200
4注释204
致谢205
参考文献205
第16章紫外可见分光光度法UVVis测定药物抗体偶联比率DAR210
摘要210
1引言210
2材料212
3方法212
3.1测定药物最大吸收λD212
3.2测定抗体和药物在280nm和最大吸收λD处的消光系数ε212
3.3获取ADC样品的吸收光谱213
3.4计算ADC的平均DAR213
4注意事项213
致谢214
参考文献214
第17章利用疏水作用色谱和反相高效液相色谱法测定药物抗体偶联比率DAR
和药物负荷分配216
摘要216
1引言216
2材料218
2.1仪器设备218
2.2HIC218
2.3RP-HPLC218
3方法218
3.1HIC218
3.2RP-HPLC220
4注意事项222
参考文献223
第18章用LC-ESI-MS测量药物抗体偶联比DAR和药物分布224
摘要224
1引言224
2材料225
2.1设备225
2.2试剂225
3方法226
3.1样品制备226
3.2LC-ESI-MS分析226
3.3DAR和药物分布的计算228
4注意事项229
致谢229
参考文献230
第19章成像毛细管等电聚焦测定电荷异质性和未偶联抗体水平232
摘要232
1引言232
2材料233
3方法234
4注意事项236
参考文献237
第20章用于测定抗体偶联药物ADC生产中的可萃取物可溶出物的基于风险的
科学方法238
摘要238
1引言238
2基于风险评估的科学方法239
3可萃取物和可溶出物研究运行方案241
4结论243
致谢243
参考文献243
索引245
彩图
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第1章抗体偶联药物研发进展
IngridSassoonandVéroniqueBlanc
摘要
在肿瘤治疗中，虽然许多单独给药的裸抗药物临床疗效有一定的局限性，但毋庸置疑的是，生物治疗手段已在癌症治疗中担当着日益重要的角色。如果将具有治疗应用前景的抗体和小分子化学药物通过偶联反应制备抗体偶联药物antibody-drugconjugate，ADC，则可以达到进一步提高抗体疗效的目的。因为ADC药物不但能特异性识别肿瘤细胞的表面抗原，而且可利用自身携带的高效小分子药物毒素杀灭肿瘤靶细胞。然而ADC药物的设计并不仅仅是简单的组合，它需要对特定肿瘤靶点和其适应证进行全方位考量，并在此基础上将抗体、连接子和小分子药物毒素三部分合理地整合在一起。现阶段大部分进入临床试验的新一代ADC药物，都是建立在不断总结第一代ADC药物的经验基础上并结合日益更新的技术所研发的。维布妥昔单抗Adcetris?是将抗CD30单克隆抗体和一种高效微管生成抑制剂偶联而成的ADC药物，用于治疗“霍奇金淋巴瘤Hodgkin’slymphoma”和“间变性大细胞淋巴瘤anaplasticlargecelllymphomas”，该产品也是迄今为止唯一成功上市的ADC药物。至今总共有27种抗体偶联药物进入临床试验2013年，适应证主要涉及恶性血液肿瘤和实体肿瘤治疗。其中，曲妥珠-美坦新衍生物trastuzumabemtansine，T-DM1是曲妥珠单抗通过不可切除连接子偶联美坦新衍生物DM1构成的。在III期临床试验中，该药物对人类表皮生长因子受体2humanepidermalgrowthfactorreceptor2，HER2阳性且难治复发转移性乳腺癌表现出显著疗效。而另一些正在进行临床试验的ADC药物，如CMC-544、SAR3419、CDX-011、PSMA-ADC、BT-062和IMGN901，其抗原靶点、连接子及所偶联的药物也越来越多样化，这使我们对ADC药物的理解不断深入，同时也使得曾经一度停滞不前的ADC药物再次迎来了新的发展机遇。为了提升疗效，ADC药物依然还面临着各种挑战，主要包括：仍需进一步提高治疗指数、靶点的精准选择、对ADC药物作用机制的透彻理解，更好地了解和控制ADC药物脱靶效应的毒副作用，以及临床试验方案的优化和确定包括患者的选择、给药方案的设计等。
关键词：抗体偶联药物，癌症，细胞毒，连接子，抗体，美坦新，奥瑞他汀Auristatin，卡奇霉素Calicheamicin，曲妥珠-美坦新衍生物T-DM1，SGN-35，CMC-544
1引言
几十年来，肿瘤学的深入研究一直在为战胜癌症并且延长患者生命这一目标而努力奋斗。如今抗肿瘤生物药如抗体、多肽和蛋白质在肿瘤治疗药物中也逐渐占有了一席之地，通常这些生物药物会与放疗和化疗药物联合使用。虽然抗体药物与小分子药物相比具有许多优势，如：①抗体药物对抗原阳性的肿瘤细胞具有高度特异性，因此可降低因药物脱靶效应对正常组织的毒性；②具有更长的半衰期等。但迄今为止只有13种肿瘤治疗的抗体药物获准上市[1]。这也再次说明确定一个靶点并通过该靶点抗原的表达水平来调控影响肿瘤增长的困难性，以及单克隆抗体药物单独给药时其临床疗效的局限性。而利用毒素、细胞毒素药物以及放射性核素改造修饰的抗体或抗体片段，已被公认为是一种既能高效杀伤靶细胞，又能实现对正常细胞和组织具有较低毒副作用的有效方法。已有部分诸如此类的抗体上市，如通过基因工程手段将人白细胞介素-2可与白细胞介素-2受体结合和白喉毒素融合而成的地尼白介素Ontak?，其适应证为顽固性或易复发的表皮T细胞淋巴瘤的治疗。替伊莫单抗Zevalin?和131I-托西莫单抗Bexxar?是两种分别与90Y和131I偶联的鼠源抗CD20单克隆抗体，用于难治复发性的滤泡性淋巴瘤治疗，而维布妥昔单抗Adcetris?则是在抗CD30单克隆抗体上偶联了高效的微管抑制剂，用于治疗霍奇金淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤。
针对改造抗体提升其疗效的思路并不是近年才兴起的，早在20世纪70年代，科研文献里就已出现ADC药物于动物模型中研究的报道。虽然基于鼠源IgG研发的ADC药物临床疗效不尽如人意，但自80年代起，已经有ADC药物获准进入临床试验研究。直到2000年，第一个ADC药物，即一种将抗CD33单克隆抗体与卡奇霉素强效DNA结合毒素偶联的新型药物——吉姆单抗奥佐米星Mylotarg?，因其可显著降低患者髓细胞恶性增殖而获得美国FDA批准，主要用于急性髓性白血病的治疗[2，3]。然而经该ADC药物上市许可后的研究SWOGS0106数据证实，其存在严重的安全隐患，并且无法证实患者的临床获益性[4]，因此2010年该产品即被开发其的辉瑞公司撤市。
本章将专注于现阶段正在进行临床研究的ADC药物表1-1。第一部分我们将为读者介绍来自第一代ADC药物研发的总结经验，以及在ADC药物设计研发过程中应用的各种改良技术，这些经验和技术对正处于不同临床研究阶段的新型ADC药物的研发会有良好的指导作用。第二部分将介绍至今最为成功的ADC药物——Adcetris的临床研究。第三部分则从现有临床前和临床研究中，在对已获得ADC药物的安全性和有效性关键参数的充分理解的基础上，对ADC药物探索和研发的进展予以综述。如今越来越多的ADC药物获准进入临床研究，不断彰显着临床医生和制药公司对ADC药物疗效的关注及信心，ADC势必会为癌症患者带来更多的福音。
2抗体偶联药物的构成
2.1抗体偶联药物的定义
抗体偶联药物可以被定义为药物前体。抗体能够识别表达肿瘤抗原的靶点，并通过连接子与细胞毒素“弹头”偶联形成针对肿瘤细胞的靶向递送系统。在理想状态下，该药物前体在系统给药时不具有毒性，而当ADC药物中的抗体与表达肿瘤抗原的靶细胞结合、整个ADC药物被肿瘤细胞内吞后，小分子细胞毒素组分将以高效活性形式被足量释放，从而完成对肿瘤细胞的杀伤。
理想的ADC药物的设计十分复杂，而并不仅仅是一个简单的组合。在精心选择表达特定肿瘤抗原靶点和相关适应证的过程中，除了考虑抗体、连接子和细胞毒素药物自身特点及局限性外，更重要的是需要找到它们之间最佳的组合方式，因为三者偶联在一起并且相互影响。
2.2抗体偶联药物识别的靶点抗原
靶点抗原的选择是设计ADC药物的起点，因为其确定了ADC药物将针对哪些肿瘤适应证，并潜在影响偶联细胞毒素药物的选择。此外，靶点的选择对该肿瘤适应证中靶向患者群体的选择标准具有决定性作用。
这些年在ADC药物的开发过程中，已评估了许多靶点[5]。在临床前小鼠模型的研究中显示了靶点的多样性，单个或多个跨膜结构蛋白或锚定的糖基磷脂酰肌醇glycosylphosphatidylinositol，GPI，都可引起ADC药物内吞，从而迟滞肿瘤的细胞生长乃至使其消退。
靶点抗原选择的基本依据是肿瘤组织中该抗原高度表达，而在正常组织中仅有限表达，从而尽可能地将ADC药物的毒性限制或集中在靶细胞。然而特异性肿瘤抗原在正常组织中不表达的概率是非常低的，在大多情况下该抗原通常在正常组织器官亚群的上皮细胞表面表达。因此，在选择靶点时，不仅应考虑表达该抗原的器官类型如重要器官与生殖器官，以及细胞亚型和所处的细胞周期状态分裂期细胞与分化静止期细胞，还应考虑在该抗原呈阳性的正常细胞和肿瘤细胞之间这一肿瘤抗原的表达差异。
值得注意的是，在临床试验中如果正常器官表达肿瘤抗原，并不一定意味着会导致严重的毒副作用。在几个与正常组织呈现交叉反应的ADC药物的临床试验中，其患者呈现了良好的耐受性，ADC药物产生的毒性不是很低，就是可控和可逆的。例如，莫坎妥珠单抗IMGN242靶向CanAg抗原，一种黏蛋白样蛋白上的糖类抗原结构[6，7]、BT-062靶向CD138抗原的ADC药物，见下文或CDX-011靶向gpNMB抗原的ADC药物，见下文。相反，在莫比伐珠单抗靶向CD44v6抗原的ADC药物的案例中，由于皮肤角质细胞[8]表达CD44v6，因此导致了严重的皮肤毒性，包括一例致命的中毒性表皮坏死松解症[9~11]，最终该ADC药物I期临床研究在早期即被终止[9~11]表1-2。
表1-2已终止的抗体偶联药物
注：ND表示未被披露。
作为靶点的抗原应在正常组织中处于较低水平的表达，而在肿瘤细胞表面抗原密度的表达水平应该较高，且该靶抗原与抗体结合后，抗原抗体复合物可被内化并在合适的细胞腔室内被加工降解，之后在细胞质中释放出足量的细胞毒素活性药物。
在临床前研究中所采用的肿瘤细胞模型，如果其肿瘤靶抗原表达模式、表达水平与来自患者活检的肿瘤细胞一致，那么该肿瘤细胞的体外研究模型则可有效地将在临床前研究所获得的数据桥接转化至相应ADC药物临床研究的疗效。靶向CD33抗原的ADC药物AVE9633，在其I期临床研究中没有显示出疗效[12]，提示该候选药物在细胞质中没有递送足量可杀死肿瘤细胞的毒素药物。相反，其临床前研究的肿瘤细胞模型却对AVE9633表现出了好的应答[13]，这是因为该肿瘤细胞模型CD33抗原的表达水平显著高于来自患者活检组织中肿瘤细胞CD33抗原的表达量来自未发表的内部数据，Sanofi，2009。
2.3细胞毒素药物和连接子
许多传统的治疗用药物已经用于抗体药物的偶联，可是之后很快发现，这些细胞毒素药物偶联至抗体后，在其后的临床使用中无法达到预期的抗肿瘤活性[14~16]。随后的研究重点则开始集中于那些天然存在的、具有高效抗肿瘤活性的细胞毒性小分子，而这类细胞毒性小分子因其临床毒性过高，通常无法单独作为抗肿瘤药物使用。
目前仅有少数几种高效细胞毒性分子及衍生物、合成类似物用于抗体的偶联，并已获准进入临床研究。这些ADC药物可分为以下两类：微管抑制剂稳定性破坏剂奥瑞他汀衍生物monomethylauristatinE，MMAE，monomethylauristatinF，MMAF、美坦新衍生物DM1和DM4，以及与DNA小沟结合的毒素卡奇霉素和duocarmycin衍生物。这两种类型的细胞毒性小分子对增殖的肿瘤细胞系都具有高效的杀伤效果[16]。DM1DM4美坦新衍生物对于肿瘤细胞系增殖存活的IC50为10–10~10–12molL[17，18]；MMAFMMAE奥瑞他汀衍生对于肿瘤细胞系增殖存活的IC50为10–7~10–10molL[19]；N-乙酰-?卡奇霉素DMH对于肿瘤细胞系增殖存活的IC50约为10–10molL[20]；DC1和CC-1065duocarmycin前体对于肿瘤细胞系增殖存活的IC50在10–11~10–12molL[14，21]。
目前已对细胞毒性小分子与抗体偶联起来的连接子设计进行了深入的研究，因为连接子对于ADC药物临床前、临床疗效和安全性都至关重要：连接子在系统循环中必须足够稳定，因为细胞毒性小分子的药物载量在循环中的释放，可产生非预期和非靶向的
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